以280 nm波長光激發時，蛋白質溶液具有內源熒光，因此可以檢測反應混合物熒光發射峰的變化. 未反應的絲素蛋白具有350 nm熒光發射峰，表明主要來自絲素蛋白的酪氨酸殘基，且處于相對親水環境中. 35 ℃條件下放置不同時間，絲素蛋白溶液熒光發射峰的位置仍在350 nm處，峰強度僅有10%的減少. 與京尼平反應時，絲素蛋白的熒光強度明顯降低，并隨反應時間延長而逐漸降低，并且熒光峰的位置由350 nm藍移到325 nm處(圖4)，說明絲素蛋白與京尼平的反應劇烈，明顯改變了絲素蛋白的結構和溶液中的構象，導致酪氨酸殘基微環境的改變.
2.4 酸堿度對京尼平與絲素蛋白反應的影響
進一步在80 ℃條件下反應2 h，測定生成物特征光吸收值，考察酸堿度對絲素蛋白與京尼平反應的影響. 表1結果顯示，溶液最大吸收峰的位置和峰的強度與溶液酸堿度密切相關. pH 8.0、10.0、11.0時終溶液呈現為藍紫色和淺紫色，具有較大的A590 nm值，表明反應完全. pH 5.0和pH 7.0條件下，反應終溶液的最大吸收峰在594 nm和595 nm處，A590 nm值較小，分別為0.3和1.4，表明反應沒有進行完全. 過酸(pH 3.0)或過堿(pH 12.0)條件下，溶液仍為無色，沒有顏色變化.
2.5 反應產物穩定性分析
一般帶色的物質對光有敏感性，容易受光照的影響，反應生成物容易發生光降解. 染色后的蠶絲于強光下暴曬1 wk，顏色沒有發生任何改變，再于水中浸泡2 d后，也沒有發生退色現象，說明京尼平與蠶絲反應所生成帶顏色的產物具有良好的穩定性.
進一步考察溶液狀態下京尼平與絲素蛋白反應生成的顏色產物的穩定性. 在室溫條件下密閉放置1 mo后，染色的絲素蛋白溶液顏色幾乎沒有發生變化，A/A0為97.3%，說明京尼平與絲素蛋白反應產物是穩定的. 自然光(實驗測定為650 lx) 照射下，短時間條件下反應產物不發生變化，而5 000 lx光強照射6 h后，最大吸收值有5%的減少(圖5). 以上研究結果表明，京尼平與絲素蛋白溶液反應的顏色產物具有光照穩定性.
3 討 論
京尼平是一種環烯醚萜化合物，含有—COOH、—OH等多個活性基團，能夠與含氮化合物發生反應[17]. 我們在研究中發現京尼平能使蠶絲染上一定的顏色. 利用絲素蛋白與京尼平在溶液狀態下反應，紫外可見光光譜分析顯示反應產物在590 nm附近處具有最大特征吸收峰，這與京尼平同氨基酸反應生成的梔子藍色素的最大吸收峰相似[16]. 絲素蛋白與京尼平反應前后的熒光發射光譜分析表明，京尼平與絲素蛋白是通過與蛋白質肽鏈中某些氨基酸側鏈發生了反應，至于是哪些氨基酸，以及如何進行反應，還有待進一步研究.
實驗結果顯示，酸堿度(pH值)對京尼平與絲素蛋白間的反應具有很大的影響. 已有的研究證明，在弱堿性條件下，溶液中的OH-可作為一個親核基團，首先攻擊京尼平C3原子，形成活性的醛基后，然后才能與蛋白質發生反應[18]，因此溶液OH-濃度的高低可能決定了反應產物的生成速度和反應進行的程度，同時也決定了產物的最終顏色，因此反應體系pH值是一個關鍵因素.
一般染料多通過本身顏色的覆蓋進行染色，也可以通過反應而生成有色物質. 常見的蛋白質染色試劑，與蛋白質的結合力較弱，主要靠分子間的作用力，因此，很容易褪色. 而蛋白質纖維更難染色. 京尼平通過與蛋白質的交聯反應形成最終的顏色產物，因此具有較好的穩定性. 京尼平是天然的梔子提取物京尼平苷的水解產物，與絲素蛋白反應具有產物顏色穩定、細胞毒性小、環境污染少等優點，可以考慮用于蠶絲的直接染色.
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