利用微生物產生的纖維素酶將纖維素糖化，再經發酵轉化成燃料乙醇，不僅可以充分利用生物質資源．更重要的是可以緩解化石能源短缺帶來的全球性能源危機。
產纖維素酶的微生物主要是真菌中的木霉和曲霉，但這類菌的最大缺點就是Β-葡萄糖苷酶的產量和活力很低．而且對葡萄糖的耐受性也很差。在纖維素分解過程中，由葡聚糖內切酶和葡聚糖外切酶轉化生成的纖維二糖若不能被一葡萄糖苷酶及時地轉化為葡萄糖，就很容易形成產物積累．在濃度較高時就會抑制纖維素酶的合成。這也是利用木霉等真菌菌株工業化生產纖維素酶產量或酶活偏低、生產成本偏高的主要原因。
本實驗室保藏的Z28是一株纖維素酶高產菌，是一株罕見的肉座菌(Hypocreasp．)，其Β-葡萄糖苷酶活力相當高。本研究對Z28的最佳生長及產纖維素酶的液體發酵工藝進行了研究，以期為將來的工業化推廣應用提供理論依據。
1試驗內容
1．1試驗材料
菌種Z28由本實驗室保藏；pNPG(對硝基酚一B—D一葡萄糖苷)購自Sigma公司；Whatmanl號定性濾紙購自廣州捷倍思生物科技有限公司：綠色木霉(Trichodemaviride)AS3．2774和AS3．3002由中科院微生物所菌種保藏中心提供。
1．2試驗用培養基
生長培養基：20g葡萄糖，2g(NH4)2S04，2gKH2P04，0．3gMgSO4·7H20，0．3gCaC12，5mgFeS O4.H2O，1．6mgMnSO4，1．7mgZnC12，l000mL水。
種子培養基(PDA)：20g葡萄糖，l000mL馬鈴薯浸汁，pH值不做調節。
產酶培養基：2gKH2PO4，2．5g(NH4)2S04，0-3gM04·7H20，0．3gCaC12，5mgFeSO4·7H2O，1．6mgMnSO4，1．7mgZnC12，1．7mgCOC12，lmLTween一
1.3試驗方法
1.3.1細菌干重的測定
將菌體培養液過濾后得到的菌絲置于80℃烘箱中烘干至恒重后稱取質量。
1．3．2玎維豢的制箭
將在PDA上培養3d的種子液按2％的接種量接種到產酶培養基上，在溫度為30℃，轉速為160r/min的條件下發酵5d，離心發酵液，取其上清液作為試驗酶液。
1．3．3紆維系的測定
CMC酶活的測定：取適當稀釋酶液0．5mL，加入2％的CMC—Na溶液lmL(以pH=5．0，0．2mol/L醋酸緩沖液配制)，在50℃恒溫水浴中反應30min．用DNS法測定還原糖量。
濾紙酶活(FPA)測定：取適當稀釋酶液0．5mL，加入pH=5．0，0．2mol/L醋酸緩沖液lmL，再加入Whatmanl號定性濾紙l條(6cmxlcm，約50mg)，在50℃恒溫水浴中反應60min，用DNS法測定還原糖量。
Β-葡萄糖苷酶酶活測定：取適當稀釋酶液0．5mL，加入pH=5．0，0．2mol/L醋酸緩沖液1．5mL，再加入2mmo~L的pNPG溶液(用pH=5．0，0．2mol/L的醋酸緩沖液配制)4mL，在50℃恒溫水浴中反應10min。加入0．5mol/LNa2CO3溶液4mL，終止反應后在分光光度計上于400nm處檢測生成的對硝基酚量。
酶單位：把lmL酶液每小時產生1umol底物(以葡萄糖或對硝基酚計)的酶量定義為1個活力單位(U/mL)。
2 Z28生長正交試驗
2．1試驗設計
碳源(A)、氮源(B)、pH值(C)和時間(D)都是影響菌體生長的重要因素，每個因子選擇3個水平，在溫度為30℃，轉速為160r/min條件下進行試驗。
2 2 試驗結果與分析
試驗結果見表2 。
由表2可知，在A3B1C1D2條件下，Z28生長最好。影響Z28生長因子的主次順序：碳源>時間>氮源>pH值。碳源是影響Z28生長的最重
3 Z28產酶正交試驗
3．1試驗設計
碳源(A)、供氧量(B)、時間(C)和表面活性劑(D)對真菌產纖維素酶能力有重要影響。碳源為不同比例的稻稈粉與麥稈粉的混合物，供氧量以裝液量來衡量。每個因子選擇3個水平進行產纖維素酶正交試驗。
3．2試驗結果
根據表3選擇適當因子的水平組合，進行9組試驗。結果見表4。
3．3試驗分析
采用極差分析法處理正交試驗數據。結果見圖1和表5。在A1B1C2D1條件下。Z28產纖維素酶能力最強，繼續減少表面活性劑。增加供氧量可提高Z28纖維素酶各組分的活力。各個因子對纖維素酶各組分誘導能力不同。對CMCase。FPA和Β-葡萄糖苷酶的具體影響有所差異。
影響CMCase活力的因子的主次順序：時間>表面活性劑=碳源>供氧量。各因子顯著性均較高，各因子水平尚有較大的提高幅度：影響FPA活力的因子的主次順序：時間>供氧量>碳源>表面活性劑，除時間外，其它因子的顯著性都不高；影響Β-葡萄糖苷酶活力的因子的主次順序：供氧量>時間>表面活性劑>碳源。各因子顯著性均較低。各因子水平可以提高的幅度不大，這是目前真菌產生的Β-葡萄糖苷酶產量和活力偏低的原因之一。繼續提高碳源中稻草粉含量能大幅度提高CMCase活力，Β-葡萄糖苷酶活力的提高不明顯，FPA在稻草粉和麥稈粉質量比為2：1時活力最高。
4與其它菌比較
將Z28，綠色木霉AS3．2774，AS3．3002在產酶培養基上進行液體發酵。測量其產生的纖維素酶的活力(表6)。從表6可以看出，Z28產生的纖維素酶的活力(尤其是Β-葡萄糖苷酶的活力)明顯高于綠色木霉AS3．2774和
5結論
在本試驗中。各個因子對CMCase．FPA和Β-葡萄糖苷酶活力的影響不同，說明不同的因子對纖維素酶各組分的誘導能力是不同的。據報道，對纖維素酶誘導效力最強的是槐糖。但其價格昂貴。本試驗以廉價的秸稈作為底物和誘導物。具有較好的應用效果。在本試驗最佳工藝條件下，CMCase活力為69．8U/mL。FPA活力為22．0U/mL，Β-葡萄糖苷酶活力為l5．2U/mL。
Β-葡萄糖苷酶能否高效分解中間產物纖維二糖一直是制約纖維素高效降解的關鍵因素之一四。本實驗室的Z28產生的Β-葡萄糖苷酶活力高，可以和其它纖維素酶高產菌組合發酵嘲，降低葡萄糖和纖維二糖對酶活的抑制度，提高纖維素的水解率，在工業上具有很大的應用潛力。
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