摘要：通過設(shè)計正交試驗，分別對影響肉座菌(Hypocreasp)Z28生長與產(chǎn)纖維素酶的4個因子進行了研究。結(jié)果表明：在偏酸性，生長60h，高C/N的條件下，Z28長勢最好；在優(yōu)化條件下，CMCase活力為69.8U/mL，F(xiàn)PA活力為22.0U/mL，Β-葡萄糖苷酶活力為15.2U/mL。
引言
利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素糖化，再經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化成燃料乙醇，不僅可以充分利用生物質(zhì)資源．更重要的是可以緩解化石能源短缺帶來的全球性能源危機。
產(chǎn)纖維素酶的微生物主要是真菌中的木霉和曲霉，但這類菌的最大缺點就是Β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量和活力很低．而且對葡萄糖的耐受性也很差。在纖維素分解過程中，由葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切酶轉(zhuǎn)化生成的纖維二糖若不能被一葡萄糖苷酶及時地轉(zhuǎn)化為葡萄糖，就很容易形成產(chǎn)物積累．在濃度較高時就會抑制纖維素酶的合成。這也是利用木霉等真菌菌株工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)量或酶活偏低、生產(chǎn)成本偏高的主要原因。
本實驗室保藏的Z28是一株纖維素酶高產(chǎn)菌，是一株罕見的肉座菌(Hypocreasp．)，其Β-葡萄糖苷酶活力相當(dāng)高。本研究對Z28的最佳生長及產(chǎn)纖維素酶的液體發(fā)酵工藝進行了研究，以期為將來的工業(yè)化推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1試驗內(nèi)容
1．1試驗材料
菌種Z28由本實驗室保藏；pNPG(對硝基酚一B—D一葡萄糖苷)購自Sigma公司；Whatmanl號定性濾紙購自廣州捷倍思生物科技有限公司：綠色木霉(Trichodemaviride)AS3．2774和AS3．3002由中科院微生物所菌種保藏中心提供。
1．2試驗用培養(yǎng)基
生長培養(yǎng)基：20g葡萄糖，2g(NH4)2S04，2gKH2P04，0．3gMgSO4·7H20，0．3gCaC12，5mgFeS O4.H2O，1．6mgMnSO4，1．7mgZnC12，l000mL水。
種子培養(yǎng)基(P
產(chǎn)酶培養(yǎng)基：2gKH2PO4，2．5g(NH4)2S04，0-3gM04·7H20，0．3gCaC12，5mgFeSO4·7H2O，1．6mgMnSO4，1．7mgZnC12，1．7mgCOC12，lmLTween一20，2g稻稈和麥稈，l000mL水。
1.3試驗方法
1.3.1細(xì)菌干重的測定
將菌體培養(yǎng)液過濾后得到的菌絲置于80℃烘箱中烘干至恒重后稱取質(zhì)量。
1．3．2玎維豢的制箭
將在PDA上培養(yǎng)3d的種子液按2％的接種量接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為160r/min的條件下發(fā)酵5d，離心發(fā)酵液，取其上清液作為試驗酶液。
1．3．3紆維系的測定
CMC酶活的測定：取適當(dāng)稀釋酶液0．5mL，加入2％的CMC—Na溶液lmL(以pH=5．0，0．2mol/L醋酸緩沖液配制)，在50℃恒溫水浴中反應(yīng)30min．用DNS法測定還原糖量。
濾紙酶活(FPA)測定：取適當(dāng)稀釋酶液0．5mL，加入pH=5．0，0．2mol/L醋酸緩沖液lmL，再加入Whatmanl號定性濾紙l條(6cmxlcm，約50mg)，在50℃恒溫水浴中反應(yīng)60min，用DNS法測定還原糖量。
Β-葡萄糖苷酶酶活測定：取適當(dāng)稀釋酶液0．5mL，加入pH=5．0，0．2mol/L醋酸緩沖液1．5mL，再加入2mmo~L的pNPG溶液(用pH=5．0，0．2mol/L的醋酸緩沖液配制)4mL，在50℃恒溫水浴中反應(yīng)10min。加入0．5mol/LNa2CO3溶液4mL，終止反應(yīng)后在分光光度計上于400nm處檢測生成的對硝基酚量。
酶單位：把lmL酶液每小時產(chǎn)生1umol底物(以葡萄糖或?qū)ο趸佑?的酶量定義為1個活力單位(U/mL)。
2 Z28生長正交試驗
2．1試驗設(shè)計
碳源(A)、氮源(B)、pH值(C)和時
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2 2 試驗結(jié)果與分析
試驗結(jié)果見表2 。
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由表2可知，在A3B1C1D2條件下，Z28生長最好。影響Z28生長因子的主次順序：碳源>時間>氮源>pH值。碳源是影響Z28生長的最重要因素，繼續(xù)提高碳含量，降低氮含量(提高C/N)，更有利于Z28的生長；偏酸性的pH值對Z28生長影響不大，這說明適于Z28生長的pH值較廣，有利于工業(yè)應(yīng)用。
3 Z28產(chǎn)酶正交試驗
3．1試驗設(shè)計
碳源(A)、供氧量(B)、時間(C)和表面活性劑(D)對真菌產(chǎn)纖維素酶能力有重要影響。碳源為不同比例的稻稈粉與麥稈粉的混合物，供氧量以裝液量來衡量。每個因子選擇3個水平進行產(chǎn)纖維素酶正交試驗(表3)。
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3．2試驗結(jié)果
根據(jù)表3選擇適當(dāng)因子的水平組合，進行9組試驗。結(jié)果見表4。
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3．3試驗分析
采用極差分析法處理正交試驗數(shù)據(jù)。結(jié)果見圖1和表5。在A1B1C2D1條件下。Z28產(chǎn)纖維素酶能力最強，繼續(xù)減少表面活性劑。增加供氧量可提高Z28纖維素酶各組分的活力。各個因子對纖維素酶各組分誘導(dǎo)能力不同。對CMCase。FPA和Β-葡萄糖苷酶的具體影響有所差異。
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影響CMCase活力的因子的主次順序：時間>表面活性劑=碳源>供氧量。各因子顯著性均較高，各因子水平尚有較大的提高幅度：影響FPA活力的因子的主次順序：時間>供氧量>碳源>表面活性劑，除時間外，其它因子的顯著性都不高；影響Β-葡萄糖苷酶活力的因子的主次順序：供氧量>時間>表面活性劑>碳源。各因子顯著性均較低。各因子水平可以提高的幅度不大，這是目前真菌產(chǎn)生的Β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量和活力偏低的原因之一。繼續(xù)提高碳源中稻草粉含量能大幅度提高CMCase活力，Β-
4與其它菌比較
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將Z28，綠色木霉AS3．2774，AS3．3002在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上進行液體發(fā)酵。測量其產(chǎn)生的纖維素酶的活力(表6)。從表6可以看出，Z28產(chǎn)生的纖維素酶的活力(尤其是Β-葡萄糖苷酶的活力)明顯高于綠色木霉AS3．2774和AS3．3002
5結(jié)論
在本試驗中。各個因子對CMCase．FPA和Β-葡萄糖苷酶活力的影響不同，說明不同的因子對纖維素酶各組分的誘導(dǎo)能力是不同的。據(jù)報道，對纖維素酶誘導(dǎo)效力最強的是槐糖。但其價格昂貴。本試驗以廉價的秸稈作為底物和誘導(dǎo)物。具有較好的應(yīng)用效果。在本試驗最佳工藝條件下，CMCase活力為69．8U/mL。FPA活力為22．0U/mL，Β-葡萄糖苷酶活力為l5．2U/mL。
Β-葡萄糖苷酶能否高效分解中間產(chǎn)物纖維二糖一直是制約纖維素高效降解的關(guān)鍵因素之一四。本實驗室的Z28產(chǎn)生的Β-葡萄糖苷酶活力高，可以和其它纖維素酶高產(chǎn)菌組合發(fā)酵嘲，降低葡萄糖和纖維二糖對酶活的抑制度，提高纖維素的水解率，在工業(yè)上具有很大的應(yīng)用潛力。
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